课题组简介
（基因工程室）

1. 研究方向

以哺乳动物（山羊，绵羊）为研究对象，分离、纯化与胚胎早期发育相关的酶和蛋白因子，确定其理化性质，克隆其基因，研究其结构和功能。
以转基因动物（猪，金鱼，小鼠）和体细胞克隆动物（山羊，家兔，小鼠）为材料，研究转基因动物外源基因的整合、定位及表达调控的机理；探讨克隆动物体细胞核在卵质中的激活﹑去分化﹑再程序化及全能性的分子生物学基础。

二，近期工作（近3年）

1. 转基因动物研究

    早在1989年成功地克隆了全长的猪生长激素基因（PGH），这在国内尚属首次；当时，在国际上，我们继澳大利亚之后成为第二个持有PGH的课题组。近3年来，对转基因猪的生理生化分析表明，外源基因的导入，影响甾类激素的分泌水平。为提高外源基因导入效率和整合效率，我们尝试了不同的转基因方法；最终建立了以脂质体为中介的新转基因方法，并申请了专利。以CHO建立PGH高效表达系统，筛选得到高效表达细胞株，用以研究外源基因位置效应，基因沉默等调控机制，已取得了很有价值的数据。总之，通过转基因猪的研究积累了相关的知识和经验，为动物分子育种﹑生物反应器﹑模型动物的建立等研究打下了基础。

2，哺乳动物早期发育相关基因的克隆
胎羊3β,20α-羟甾醇脱氢酶（3β,20-Hydroxysteroid Dehydrogenase, 3β.20α-HSD）是一种与胎羊的早期发育密切相关的甾类氧化还原酶，本课题组对该酶做了深入而系统的研究。首次成功地从胎羊红血球中分离得到纯化的3β,20-HSD；对其理化性质进行了全面分析。所测得的理化常数如：Mr, Km, Ki, Vmax 和PI 已为酶学手册收录。用合成的特异底物类似物进行亲和标记﹑胰酶水解﹑HPLC肽段纯化﹑AA序列分析等方法最后确定了3β,20α-HSD的活性中心一级结构；并用底物竞争实验首次证明了该酶单一活性位点具有双底物活性特性。克隆3β,20α-HSD基因，了解其调控机制，弄清其与胚胎早期发育的关系是下一步研究的主攻方向。目前已完成了3β,20α-HSD 的cDNA建库，并克隆了部分cDNA片段。基因组文库也已构建成功，克隆3β,20-HSD基因的工作也已启动。
羊发情相关糖蛋白（Estrus-associated glycoprotein, EGP）是羊输卵管上皮纤毛细胞分泌的一种糖蛋白，它与卵成熟，精子获能，受精及早期胚的发育密切相关。当受精卵移动到子宫着床后，EGP随既消失；显然EGP是一种有特殊生理功能的糖蛋白，其分子作用机制尚不清楚。本课题组从发情羊输卵管液中纯化了EGP，并用双向电泳,等电聚焦，Western Blot等方法确定了其Mr.,PI的值。申请人主持的研究组完成了中国山羊EGP的cDNA克隆，得到了全长的cDNA序列；目前在完成山羊基因组文库构建的基础上，成功地克隆了EGP基因片段，部分序列分析表明所得DNA片段确实是EGP的基因片段。全序分析正在进行。

3, 体细胞克隆胚再程序化分子作用机制的研究
体细胞克隆动物分子机制的研究已取得阶段性成果，DD-RT-PCR法（差异显示逆转录PCR法）和单细胞减法PCR构建cDNA文库法（Subtracted PCR-Generated cDNA Libraries）已经建立; 现已得到10多条与早期兔克隆胚再程序化相关差显片段和20多条与小鼠早期胚发育相关差显片段，对这些差显片段的鉴定和分析正在进行中；预计短时间内可克隆到与重构胚再程序化相关的基因。

  近3年发表论文12篇，申请专利2项。

三，创新目标（后3年规划）

1），动物早期发育相关基因的克隆
动物的个体发育是由成千上万个基因按着一定的时空程序进行特异性表达的过程，这一过程受到精密调控，以保障动物的正常发育。因此鉴定，分离和克隆DNA调控元件及蛋白因子是分子发育生物学的中心课题。胎羊3β,20α-羟甾醇脱氢酶（3β,20α—Hydroxysteroid Dehydrogenase;3β,20α-HSD）仅存在于胎羊的红血球中，胎羊一旦出生，该酶活性很快消失。虽然人们已对该酶的理化性质有了较为深入的研究，但对胎羊的发育有何影响至今未知。因此克隆3β,20α-HSD的基因，研究其表达调控与胎羊发育的关系，有可能揭示3β,20α-HSD的生理功能。羊发情特异糖蛋白（EGP）仅存在发情羊的输卵管液中，一般认为它与卵成熟，精子获能，受精及受精卵的早期发育有关系，但其确切生理功能及分子作用机制并不清楚。所以克隆EGP基因，弄清EGP的分子作用机制，对研究羊受精卵的早期发育有重要意义。对3β,20α-HSD和EGP的研究本课题组已有相当的工作基础，克隆羊3β,20α-HSD和EGP基因至今国外尚无报道。
2），动物克隆的基础理论研究
自从1997年2月英国罗斯林研究所克隆Dolly成功后，至今已有十几种动物得到克隆。但总的看来成功率很低，技术路线远未成熟，离实际应用尚有距离；究其原因是基础理论研究没有跟上，对克隆缺乏必要的理论指导，仅凭经验，其成功具有偶然性。因此开展动物克隆的基础理论研究势在必行。对动物克隆的研究将侧重于体细胞核在卵质中去分化和再程序化因子的鉴定及其基因的克隆。用mRNA差异显示法比较相同发育阶段的体细胞胚和受精卵胚的表达差异或比较不同发育阶段的体细胞胚间的表达差异；筛选差异片段，经序列分析后，克隆其基因组基因，随后用转基因的方法和基因剔除的方法研究其生理功能。同时开展体细胞核潜能性的研究，用不同类型的体细胞作核供体，比较其重构胚的发育率；并不断改进克隆技术，最终为提高动物克隆效率提供可行性方案。
3），高效表达载体的构建和细胞检测系统的建立
在转基因动物的研究中，除存在转基因效率低的问题外，外源基因表达水平低也是常遇到的问题；因此若获取有经济效益的转基因动物，就要设法解决以上问题。影响转基因表达的因素是多方面的，但表达载体结构的合理性是很关键的。为此要从三方面考慮表达载体的构建：A，各调控元件的匹配；B，Marker 基因的选择和使用；C，密码子的偏向性及表达产物的免疫源性。一般对表达载体效能的鉴定直接采用转基因动物，但这样做费时费力，很不经济；为此建立一套快速有效的细胞检测系统十分必要。把表达载体导入稳定培养的细胞系（或干细胞系），分析其表达水平，以判断构建的表达载体表达效率；若能鉴定出高效表达细胞株，可用作细胞核供体，进行克隆动物研究，可望获得高效表达转基因动物。

后三年具体规划目标如下：
1），克隆1-2个发育相关基因；得到授权的专利一项。
2），用差异显示法分离鉴定2-4个克隆胚不同发育阶段的差异表达基因，并研究其调控机制。
3），构建高效表达载体，建立细胞检测系统。
4），发表文章4-8篇(SCI)。
5），培养硕士生3-4名，博士生3-5名。

English Version

Qingxuan Chen
Invetigator and Laboratory Head

Email: qingxuanchen@yahoo.com

The laboratory called “Gene Engineering Laboratory” was founded in 1980 which research field is molecular developmental biology of mammal. One of the important projects(was supported by ‘863’ program) in this laboratory was to produce transgenic animals with growth hormone gene from different animals. The studies were performed on integration, location, expression and regulation of foreign gene in transgenic animals. Another project(supported by National Natural Science Foundation of China) is the isolation, purification  and characterization of 3β,20α-Hydroxysteroid Dehydrogenase(3β,20α-HSD) and its gene cloning.  3β,20α-HSD exists just in fetal blood. When the baby was born, the 3β,20α-HSD disappeared soon from its blood. It is clear that the 3β,20α-HSD has certain relationship with the development of the early embryo.  So, to study the molecular  mechanism of 3β.20α-HSD in  the embryo  is the main subject in this Lab. Cloning of the goat estrus-associated oviductual glycoprotein(gEGP) gene is one of interesting project in this Lab and a part of gEGP gene has been cloned. A new project was started last year,that is “Studies on dispelling differentiation, reprogramming and developmental totipotency of transplanted nucleus in the cytoplasm of oocyte”,which was supported by the Major State Basic Research Development Program(called ‘973’).More recetly,some interesting data were obtained with DDRT-PCR method and some differential fragments were identified which just appeared in the early stage of developmental embryo. The further studies of the differential fragments are carrying on. We are more interested in study of molecular mechanism of aging and anti-aging. In preparing the studies, “SAM” mice  were imported from Japan last year. We have got some support for this field studies from “Ling Tai Chinese Traditional Medicine Company” and the studies would be started recently.

Key publications:
1), Shengwei Zou,Frederick Sweet,Qingxuan Chen,(2002) Molecular cloning of goat fetal liver
cDNA encoding 3β-Hydroxysteroid dehydrogenase/△4-△5 Isomerase,Biochemical and
Biophysical Research Communication. In press.
2), Weidong Yu  Lixin Yang Guisheng Liu Wenyong Li Qingxuan Chen,(2002) The Complex
Prescription for Invigorating Liver and Kidney Activates Mitochondrial ATP Synthase-6
Expression in B-16 Murine Melanoma cell The Journal of Chinese Medicine, in press.
3), Qingxuan Chen,Guisheng Liu,Frederick Sweet,(2002) Analysis of homology among DNA
fragments for estrous-associated oviductal glycoprotein from primates.Evolution, in press.
4), 郁卫东，扬立新，李文雍，刘桂生 陈清轩，（2002）单个植入前胚胎的mRNA差别显示
法分离小鼠早期发育相关基因。中国科学，已送审。
5), 郁卫东 杨立新 刘桂生 李文雍 陈清轩,(2002)滋补肝肾方诱导B16细胞线粒体中ATP
合成酶-6的基因表达,生物化学与生物物理进展,已送审。
6), 徐庆勇，刘桂生，陈清轩，（2002）山羊(Capra hircus)发情相关输卵管糖蛋白(gEGP)基
因克隆，中国生物化学与分子生物学报。18（4）：在出版中。
7), 牛屹东，陈清轩，（2001）转pGH基因猪外源基因染色体定位研究，生物工程学报；173）：
318-320．
8), Chen Qingxuan,He Xin, (1997) Location of an exogenous pGH gene on chromosomes of
transgenic pigs.Developmental & Reproductive Biology,6(1):51-56.
9), 陈清轩，等 （1997） 猪生长激素基因表达质粒的构建及其转基因动物研究，生物化
学杂志，13（5）：540-546。
10),奋进功，陈清轩等，（1998） 牛促卵泡激素α亚基cDNA的克隆与序列分析，生物化
学与生物物理进展，25（2）：159-162。